本发明属于化学制药领域，具体地涉及9位含曼尼希碱的四环素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
1、四环素类抗生素是由放线菌链霉菌属发酵产生的一类口服广谱抗生素，对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，而且对立克次体、支原体、衣原体、性病淋巴肉芽肿病原体、包涵体结膜炎病原体和鹦鹉热病原体等有很好的药理学效应。
2、第一个四环素类抗生素是1948年从金色链丝菌分离得到的金霉素，随后相继发展了土霉素、四环素及地美环素，都属于天然产物，具有高度耐药性和多种副作用。之后，对这些化合物的化学结构进行了研究，合成了去甲基四环素类抗生素、二甲胺四环素类抗生素。然而，由于广泛使用四环素导致细菌对这些抗生素的耐药性越来越严重，使得四环素类抗生素在使用中全面减少。
3、常见的含有曼尼希碱(mannich base)的四环素抗生素有两种：奥玛环素和萨瑞环素。其中奥玛环素(ptk-0796)是由paratek pharma开发的新型氨基甲基环素类的第一个成员，其结构式如下：
4、
5、奥玛环素是米诺环素的半合成衍生物，是新型氨基甲基环素类的第一个成员。c7和c9位置的结构修饰使奥玛环素能够克服细菌耐受四环素的两种主要机制，即药物外排机制和核糖体保护机制，且有更少的不良反应。2018年由fda批准用于成人急性细菌性皮肤和皮肤结构治疗，也可用于治疗复杂性的尿路感染。
6、比较米诺环素和奥玛环素的结构，差别只在9位多了一个mannich base，观察其他四环素类抗生素，如萨瑞环素的7位同样也是一个mannich base。萨瑞环素结构式如下：
7、
8、目前四环素类化合物构建mannich base的方法，以奥玛环素为例，主要有如下三种方法。
9、路线一：首先通过米诺环素与氨基烷基化试剂羟甲基邻苯二甲酰亚胺反应，经甲胺脱去保护基得到9-氨甲基衍生物，特戊醛还原氨化，得到奥玛环素。该路线不使用昂贵得金属催化剂和有机配体，但9-氨甲基米诺环素极其稳定，而且还原胺化时使用硼化物，副反应多，后处理复杂，纯化困难，使产品收率偏低，收率为35％。因此，该路线难以适合工业生产。
10、
11、路线二：2，2-二甲基丙胺和多聚甲醛反应得到三嗪化合物，再与酸酐反应得到侧链连接体，通过tscherniac-einhorn反应连接侧链与米诺环素，然后水解氯乙酰基和羟甲基得到奥玛环素。该路线反应条件比较温和，但存在反应步骤长，产率偏低等问题，产率45％，纯度>98％。
12、
13、路线三：米诺环素与碘代试剂反应得到9-碘代米诺环素，再将其转化成9位的醛基衍生物，最后与特戊胺，氢气在钯碳催化下，还原得到奥玛环素。此路线虽然操作简单，原材料简单，但使用了金属催化剂和昂贵得配体，此路线的产率为69％，但纯度只有64.91％。
14、
15、对于含有mannich base的四环素抗生素，其合成路线表明，目前四环素类抗生素的合成方法中，对于接mannich base的方法均存在步骤长，操作繁琐，收率偏低或纯度不佳，有的还需要使用贵金属和配体、不利于工业化生产等问题。如果四环素类抗生素的mannich base可以通过一种更简单的方式接到四环素上的，对奥玛环素合成工艺改进有巨大推进，且给四环素类抗生素的新药开发以及工艺改进提供一个新的思路。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中四环素类化合物的合成方法中，对于接mannich base的方法中存在的步骤长、操作繁琐、收率偏低或纯度不佳、有的还需要使用贵金属和配体、不利于工业化生产等缺陷，而提供9位含曼尼希碱的四环素类化合物及其制备方法和应用。本发明的在四环素类化合物接mannich base的方法步骤简单、反应条件温和、可操作性强、经简单纯化即可得到较高纯度的产品。
2、本发明提供了一种如式ι所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物的制备方法，其包括以下步骤：
3、在溶剂中，将如式i-a所示的化合物、如式sm-1所示的化合物和甲醛进行如下所示的反应，得到如式ι所示的化合物；
4、
5、其中：
6、x存在或不存在，当x存在时，其为无机酸；
7、r9a和r9b各自独立地为氢、c1-c6的烷基、卤素取代的c1-c6的烷基、c1-c6的烷氧基、6-9元螺环基、6-9元杂螺环基、6元饱和稠环基或6元饱和杂稠环基；其中，所述的6-9元杂螺环基和6元饱和杂稠环基中的杂原子选自n、o和s，杂原子个数为1、2或3个；
8、或r9a和r9b与所连接的n原子一起形成4-6元杂环基、卤素取代的4-6元杂环基、6-9元杂螺环基或6元饱和杂稠环基；其中，所述的4-6元杂环基、6-9元杂螺环基和6元饱和杂稠环基中的杂原子选自n、o和s，杂原子个数为1、2或3个。
9、优选地，所述r9a和r9b各自独立地为c1-c6的烷基或卤素取代的c1-c6的烷基；进一步优选为c1-c6的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、特戊基，最优选为甲基或乙基，特别优选地r9a和r9b同时为甲基或同时为乙基。
10、优选地，所述r9a和r9b与所连接的n原子一起形成4-6元杂环基或卤素取代的4-6元杂环基，更优选4-6元杂环基。所述4-6元杂环基优选为五元含氮杂环基或六元含氮杂环基，进一步优选为四氢吡咯基或六氢吡啶基。
11、优选地，所述如式i-a所示的化合物优选为盐酸盐。
12、优选地，所述甲醛为甲醛水溶液(37wt.％)或多聚甲醛，优选为甲醛水溶液(37wt.％)。
13、优选地，所述的反应在气体保护下进行反应，进一步优选地，所述的反应在氮气保护下进行反应。
14、优选地，所述溶剂为有机溶剂和水的混合溶剂。其中，所述有机溶剂优选为醇溶剂、酰胺类溶剂和亚砜类有机溶剂中的一种或多种，更优选为醇溶剂。所述醇溶剂优选为甲醇、乙醇和丙醇中的一种或多种，更优选为甲醇。优选地，所述水为去离子水。所述有机溶剂和水的用量可不做具体限定，以不影响反应进行即可。所述有机溶剂和水的体积比优选1:1-10:1，优选2:1-5:1。
15、优选地，所述如式i-a所示的化合物与所述有机溶剂的质量体积比为1:2-1:50，进一步优选为1:2-1:20(例如1:10)。
16、优选地，所述如式i-a所示的化合物与所述水的质量体积比为1:2-1:50，进一步优选为1:2-1:20(例如1:5)。
17、优选地，所述如式i-a所示的化合物和如式sm-1所示的化合物的摩尔比为1:2-1:50，进一步优选为1:2-1:20，最优选为1:4-1:6。
18、优选地，所述如式i-a所示的化合物和甲醛的摩尔比为1:2-1:50，进一步优选为1:2-1:20，最优选为1:4-1:6。
19、优选地，所述反应的反应温度为50℃-120℃，优选60℃-80℃。
20、所述的反应进程一般以反应不再进行作为反应的终点。优选以hplc检测反应液中如式i所示的化合物的含量在5％以下作为反应的终点。
21、优选地，所述如式ι所示的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
22、(a)将如式i-a所示的化合物与溶剂混合，得一混合物；
23、(b)将如式sm-1所示的化合物和甲醛加入步骤(a)得到的混合物中进行反应，得到如式ι所示的化合物。
24、优选地，步骤(a)中混合的温度为10℃-40℃，进一步优选为25℃。
25、优选地，所述(b)将如式sm-1所示的化合物、甲醛依次加入经(a)得到的混合物中进行反应，得到如式ι所示的化合物。
26、所述反应结束后，其还包括后处理的步骤，后处理包括下列步骤：
27、(1)除去反应结束后得到的混合溶液浓中的溶剂，得到一混合物，然后与水混合，得一混合液；
28、(2)将步骤(1)所得混合液的ph值调节到1-10，得待纯化溶液；
29、(3)将步骤(2)所得待纯化溶液进行分离纯化，得目标化合物。
30、优选地，步骤(1)中，将反应结束后得到的反应液进行减压浓缩得到一混合物，所述减压浓缩时的温度可为10℃-80℃，优选为30℃-50℃，进一步优选35℃以下，更优选为室温。
31、优选地，步骤(1)中，所述水优选去离子水。所述如式i-a所示的化合物和水的质量体积比为1:2-1:50，优选1:10-1:20。
32、优选地，步骤(2)中，将步骤(1)所得混合液的ph值调节至2-3、4-5、5-6或7-8。
33、优选地，步骤(2)中，可用无机酸或有机酸调节ph值，优选地，所述无机酸为盐酸、硫酸或硝酸，最优选为盐酸，例如浓盐酸。优选地，所述有机酸为对甲苯磺酸。
34、优选地，步骤(3)中，所述分离纯化为通过柱层析分离纯化。所述柱层析填料优选为xad系列大孔树脂。所述xad系列大孔树脂优选为xad4、xad7hp、xad16hp、xad1600、xad1600n、xad1180或xad761大孔树脂，更优选地为xad1180大孔树脂。所述柱层析的柱子规格与待纯化溶液的体积比为2:1-5:1，优选2.5:1-3.5:1。
35、优选地，步骤(3)中，所述柱层析流动相为流动相a和流动相b，所述流动相a为醇类溶剂，例如甲醇和/或乙醇，所述流动相b为水，例如去离子水。
36、优选地，步骤(3)中，所述柱层析的柱子先用水洗，再将待纯化溶液加到所述柱子中进行分离；所述水优选为去离子水，所述水与待纯化溶液的体积比为10:1-20:1。
37、优选地，步骤(3)中，所述待纯化溶液加到所述柱子中后，先用水洗柱子，所述水优选为去离子水，所述水与待纯化溶液的体积比为10:1-20:1。
38、优选地，所述柱层析为梯度洗脱，流速为2ml/min-5ml/min，所述流动相梯度变化及用量如下表所示；
39、
40、步骤(3)中，收集含目标化合物的洗脱液，除去溶剂(减压浓缩)，干燥(减压烘干，烘干温度例如0℃-100℃，优选为20℃-50℃，更优选为35℃)即可。
41、本发明还提供了一种如ⅰ所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物或其药学上可接受的盐。
42、
43、其中，所述r9a和r9b的定义如前所述，但r9a和r9b不同时为氢。
44、优选地，所述的如ⅰ所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物为下列任一化合物：
45、
46、本发明还提供了一种药物组合物，其包括如前所述如ⅰ所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料。
47、本发明还提供了一种如前所述如ⅰ所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由细菌、病毒或微生物感染引起的疾病的药物中的应用。
48、所述由细菌、病毒或微生物感染引起的疾病可为由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、立克次体、支原体、衣原体、性病淋巴肉芽肿病原体、包涵体结膜炎病原体或鹦鹉热病原体引起的疾病。
49、所述由细菌、病毒或微生物感染引起的疾病可为由金黄色葡萄球菌(staphyloccocus aureus)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)或大肠杆菌(escherichia coli)或其耐药菌引起的疾病。
50、本发明中，必要时可对需要保护的官能团进行保护，此后通过常规方法脱去保护基团。
51、本发明中，所述的用大孔树脂分离纯化包含以下步骤：用xad系列大孔吸附树脂的分离柱对反应所得的反应液进行分离纯化，即可得纯度更高的如前所述如ⅰ所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物。所述的xad系列大孔吸附树脂的分离柱的操作步骤和操作条件可按照常规的xad系列大孔吸附树脂的分离柱的操作步骤和操作条件进行选择。
52、在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。
53、本发明式i所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物的“药学上可接受的盐”，是指当式i所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物中存在酸性官能团(例如-cooh、-oh、soh等)时，与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，包括与碱金属如钠、钾、锂等形成的盐；与碱土金属如钙、镁等形成的盐；与其他金属如铝、铁、锌等形成的盐；与无机碱如铵等形成的盐；与有机碱如叔辛基胺、哌嗪、四甲基胺、三(羟甲基)氨基甲烷等形成的盐；以及当式i所示的9位含曼尼希碱的四环素类化合物中存在碱性官能团(例如-nh2等)，与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，包括与无机酸如硝酸、高氯酸、硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸等形成的盐；与磺酸如甲磺酸、对苯磺酸等形成的盐；与有机酸如醋酸、苹果酸、富马来酸等形成的盐；与氨基酸如甘氨酸、三甲基甘氨酸、天冬氨酸等形成的盐。
54、本发明所用试剂和原料均市售可得。
55、本发明的积极进步效果在于：本发明的接mannich base的方法步骤简单、反应条件温和、可操作性强、经简单纯化即可得到较高收率和纯度的产品。